TECNICA PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR)

El PCR es una tecnica que de manera artificial duplica  "n" veces una fragmento o una cadena de ADN

Veamos algo de su Historia:

Hasta 1980 .Antes de que se diseñara esta técnica si era posible duplicar  fragmentos de ADN, esto era posible por la incorporación en bacterias del fragmento que se deseaba duplicar, y aprovechando su capacidad de división obtenia varias copias.Lo malo es que era muy tedioso y demandaba mucho tiempo y muy costoso

El invento del RCP surgió en el año 1983, por el Bioquímico Kary Mullis mientras trabajaba en los laboratorios CETUR Corporation y en 1993 Kary Mullis se lleva el Premio novel de Química por su aporte Pero su técnica tenia un problema, y demandaba la utilización de varias polimerasas.(Mas adelante les mostrare cual es fue su Dolor de Cabeza).

CURIOSIDAD!!: La gran idea surgió de improviso sin pensarlo cuando  Kary Mullis  conducía su auto! 

La Tecnica se basa en la Manipulación de la temperatura, tres manipulaciones para ser exactos.

la primera es de 96ºC , la segunda de 54 ºC y la tercera de 75ºC. y se calsifican en tres etapas:

1.- Desnaturalización.

2.- Hibridación o recocido.

3.- Elongación.

¿En que consiste la prueba?.

Consiste en Duplicar un Fragmento de ADN, pero Manipulando la Temperatura!!! 

Pero la técnica se FUNDAMENTA en la función natural de las Polimerasas en duplicar ADN.

para la elaboración de esta técnica se necesitamos lo siguiente: 

Para un ciclo de replicación se necesita lo siguiente:

1)8 Desoxirribonucleiosidos-Trifosfato (dNTP: dATP, dCTP,dGTP,dTTP) = QUE ES ESTO?¿

Son los sustratos que el Taq polimerasa va utilizar para que apartir de ellos formar la nueva molécula de ADN, nota!!! El dATP te dará adenina, el dCTP dará citocina y así los otros.

2) 2 Cebadores: Los cebadores son fragmentos de ADN de solo 20 pares de bases nitrogenadas (oligonucleotidos) estos señalan el sitio donde debe actuar el Tap polimerasa para comenzar la replicación.

son altamente específicos y por ellos se logra la duplicación del fragmento deseado. Se utilizan 2 porque  vana señalar amas cadenas  primitivas osea va a acoplarce cada una a las 2 cadenas  originales.

3) Iones Divalentes y monovalentes : Los iones como el Mg++ , Cl ++ , Mn++  actúan como cofactores!!! quiere decir que  permite que la enzima Tap polimerasa se active y actúe. así también como el ion monovalente K+

4)Solución Buffer: Esta solución mantiene el Ph adecuando para que el ADN polimerasa (Taq polimerasa) tenga 100% de eficiencia. La solución contiene KC, Cl, (dando un ph de 8.3a temperatura ambiente) y MgCl2, estos elementos sostendrán el Ph adecuado.

5) Taq Polimerasa ??( que es esto, porque Taq): Como bien sabemos a 96 ºC toda clase de proteínas en nuestro cuerpo y de la mayoría de los seres vivos se desnaturalizan, es por esto que se tuvo que utilizar  ADN polimerasa de otros organismos vivos que puedan soportar estas temperaturas, y entre ellas estubo una bacteria llamada Thermococcus litoralis, que soporta  elevadas temperaturas hasta de 75ºC y aguanta 45 minutos a 95 ºC, es por eso que se extrajo su ADN polimerasa y se le dio el nombre de Taq polimerasa, asiendo alucion a su nombre, eso es todo el rollo del Taq polimerasa.

NOTA!!!!

Hay que recordar de que en la replicación natural suelen aparecer errores y claro se corrigen. En la replicación artificial (PCR) también suelen cometerse errores que deben corregirse de algún modo, es por eso que junto con las Taq polimerasa están los Vent y Pfu ( que son enzimas de corrección de 2 bacterias = de resistentes a altas temperaturas llamadas Pyrococcus Friosus (Pfu) y Thermococcus Litoralis (Vent). 

6) ADN molde: que es tu muestra que contiene la región molde que se quiere amplificar.

7) Termociclador: Es el aparato que se encarga de hacer los cambios de temperatura necesarios para la replicación.

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CONTINUARAAA...............